肌肉疾病（肌病）的诊断往往存在较大难度，临床亟需全新的疾病生物标志物，以完善临床诊疗工作与科学研究。尽管影像学、基因组医学等领域已取得长足发展，但肌肉活检仍是一项关键检查手段，该方式检测流程耗时较长。拉曼光谱属于振动光谱检测技术，无需复杂样品前处理、操作简便，可实现肌肉组织的快速分析。本研究探究了小型化便携式光纤拉曼系统快速鉴别肌肉疾病的应用可行性。研究样本取自 27 例经临床病理最终确诊为肌病的患者，以及 17 例经临床检查与长期随访排除肌病的患者。经多元分类算法分析，检测准确率可达 71%～77%。为进一步探究拉曼光谱区分不同类型肌病的应用潜力，研究人员将肌病患者划分为线粒体肌病组与非线粒体肌病组，两组别的分类准确率为 74%～89%。研究观测到的光谱变化，主要与蛋白质结构改变相关。上述研究结果表明，光纤拉曼光谱是一种极具应用前景的肌肉疾病快速检测技术，能够实时提供诊断参考信息。光纤拉曼技术的应用，有望实现肌肉疾病的床旁活体检测，大幅简化此类疾病的整体诊断流程。
一、引言
肌肉疾病，又称肌病，是一类具有高度异质性的疾病统称，主要特征为骨骼肌组织出现组织学结构与生理功能异常。肌病可在全年龄段发病，依据致病诱因不同，患者会表现出肌无力、肌肉疼痛、身体乏力等多种临床症状。此类症状多集中累及上下肢近端肌肉，以肩带肌群与骨盆带肌群受累最为常见。
肌肉疾病的分类体系较为复杂。从基础分类层面，可将肌肉疾病分为遗传性疾病（如杜氏肌营养不良）与获得性疾病（如炎症性肌病）两大类，且每一大类下还包含繁多的细分亚型。不同病因引发的肌肉疾病症状高度重叠，给临床诊断带来极大挑战。因此，即便在可优先对接神经科专科医师的医疗体系中，患者的平均确诊时长仍超过 3 年。多数肌肉疾病呈慢性进展，会造成严重机体损伤，同时产生高昂的社会经济负担。研发适用于临床诊疗与科研场景的快速、简易检测手段，仍是目前尚未被满足的临床需求。
目前，针对肌病带来的临床诊断难题，临床主要采用临床评估结合多项联合检查的模式，各类检查手段均存在各自的优势与不足。例如，常规血液检测包含多种非特异性筛查项目，肌酸激酶便是其中一种肌肉酶类指标，该指标在特定情况下可用于监测疾病活动度，但难以精准预判潜在的肌肉病变类型。神经传导检查与肌电图（EMG）可分别记录神经与肌肉的电生理活动。此类检查能够判断是否合并神经或神经肌肉接头损伤，明确肌肉病变的解剖分布特征，为疾病病因推断提供参考依据。但该类检测的最终结果缺乏疾病特异性。磁共振成像（MRI）、超声检查（USS）等影像学技术，可清晰呈现异常病变肌肉的分布特征。肌电图（EMG）与影像学检查均能够为肌肉活检的取材部位选择提供参考。全外显子测序、全基因组测序等新一代测序技术逐步融入临床诊断流程，推动先天性肌病、线粒体肌病等部分肌病形成 “基因组优先” 的新型诊断模式。
尽管临床可选用的检查手段种类丰富，但肌肉活检依旧是肌病诊断流程中的核心环节，可对病变肌肉组织开展基因检测、组织学分析与生化检测。例如，在线粒体疾病中，部分线粒体 DNA 稳态异常类病变，仅会在分裂后肌肉组织中表现出病理特征。此外，部分致病性基因变异仅能在肌肉组织中被检出，如肌肉限制性线粒体 DNA 突变。因此，肌肉活检可辅助完成临床病理诊断，同时为基因检测与遗传咨询提供指导。不仅如此，肌肉活检还可用于明确意义未明基因变异的功能关联，助力临床对基因检测结果进行合理解读。肌肉活检样本可检出的病理异常类型繁多，导致样本处理流程复杂，需要依托高度专业化、耗时较长的检测技术与专业分析研判。
拉曼光谱技术利用单色光探测样品的化学组分，通过分析非弹性散射光的频率特征，获取样品内部化学键的分子信息。在组织检测领域，该技术可形成样品专属的 “生化指纹图谱”。自发拉曼光谱是操作最简单的拉曼检测技术，仅需单组激光设备，且无需对样品进行前处理。光纤检测模式的性能持续快速升级，使其有望在各类临床场景中实现组织实时检测。近年来，拉曼光谱技术在神经系统疾病鉴别领域展现出良好应用潜力，其中也包含各类肌病的检测与诊断。
本研究采用离体人体肌肉样本，受试对象包含基因检测确诊肌肉疾病的患者，以及疑似肌肉疾病、正在接受临床排查的患者。本研究旨在验证以下研究假设：便携式光纤拉曼光谱技术可在无需任何样品前处理的条件下，识别病变肌肉组织。
二、研究方法
2.1. 研究对象
本研究共纳入 44 名研究对象，每名对象各采集 1 份肌肉样本。样本通过开放式活检或环钻针式活检方式获取，严格遵循当地标准操作规范，分别于谢菲尔德与纽卡斯尔两地完成快速冷冻处理。患者招募与样本采集分为两种情况：疑似肌病接受临床检查的患者，以及经基因检测确诊线粒体肌病的患者。针对疑似肌病的受试人员，研究人员持续开展临床随访，直至明确最终诊断结果。数据分析阶段，所有样本首先分为两组：经肌肉活检结合临床背景确诊为 “肌肉疾病” 的患者组，以及确诊为其他疾病的 “非肌肉疾病” 对照组。再将肌肉疾病组进一步划分为两类：经基因确诊的线粒体疾病患者（下文统一称为线粒体肌病），以及非线粒体肌病患者。本研究人体组织样本的使用已获得英国国家医疗服务体系研究伦理委员会批准；全程严格遵循良好临床规范（GCP）相关准则，所有研究对象均已签署正式知情同意书。受试人员的基础人口学资料与临床特征详见表 1.。肌肉活检结果及更多临床详细信息见 ESI 表 1.。
表1. 临床资料
线粒体是结构复杂的细胞器，其遗传调控同时受细胞核基因组与线粒体基因组共同支配，两类基因组异常均与线粒体肌病的发生相关。目前尚未完全阐明具体机制，相同的致病突变可引发多种临床症状，而相同的临床症状也可由多种不同突变诱发。本次研究队列中，各类突变对应的临床综合征汇总详见 ESI 图 1.。致病性 m.3243A > G 变异是检出率最高的异质性线粒体 DNA（mtDNA）变异。绝大多数致病性 mtDNA 变异均为异质性，即同一细胞或组织内同时存在野生型与突变型线粒体 DNA。变异异质性水平以百分比形式呈现，相关数据详见 ESI 图 1.。单一大片段线粒体 DNA 缺失同样属于异质性变异，会造成线粒体信使 RNA（mt-mRNA）与线粒体转运 RNA（mt-tRNA）基因缺失。POLG 相关线粒体疾病患者携带 POLG 基因隐性遗传变异，该基因负责编码线粒体聚合酶 γ（pol γ）的催化亚基，该蛋白是线粒体 DNA 复制过程的关键功能蛋白。
2.2. 拉曼光谱检测
光纤拉曼探头的结构与参数已有相关文献介绍（详见 ESI 图 1.）。简单来说，直径 0.5 mm的光纤拉曼探头内置在标准 21 号皮下针头中，搭配 830 nm半导体激光器（Innovative Photonics Solutions），探头尖端输出激光功率为 60 mW。该探头由一根低羟基激光发射光纤与一根规格一致的拉曼信号收集光纤组成。在距离探头远端约 15 cm处设置在线激光带通滤光片，用于滤除激光传输光纤内部产生的拉曼非弹性散射光与自发荧光。配套长通滤光片可阻挡弹性散射光，避免其在信号接收光纤中产生杂散拉曼信号与荧光干扰。该探头的有效检测体积约为 0.25 mm∧（3）。信号收集光纤与光谱仪完成光学耦合对接。所有样本统一保存于零下 80 摄氏度环境，检测前恢复至室温。拉曼信号单次采集曝光时长为 40 秒。根据样本尺寸差异，每份样品选取 2 至 6 个检测位点采集光谱数据。
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2.3. 数据分析
数据分析基于 MATLAB 软件完成。研究人员采用自定义程序脚本，对单一样本的多条光谱数据进行平均化处理，最终每份样本对应一条整合光谱。不同波数下各样本的变异系数，即组内个体差异，详见 ESI 图 2.。将平均化光谱进行插值处理，有效截取 900 cm∧（-1）至 1800 cm∧（-1）区间信号；波数低于 900 cm∧（-1）的光谱信号主要受光纤二氧化硅背景干扰，波数高于 1800 cm∧（-1）的区间仅存在无有效信息的噪声信号。采用二阶萨维茨基–戈莱平滑算法、5 个数据点窗口宽度对光谱进行降噪平滑处理，结合自适应迭代加权惩罚最小二乘法（airPLS）算法扣除光谱基线背景。随后采用标准正态变量变换法完成数据归一化。开展多元统计分析前，所有数据先进行均值中心化预处理，再实施主成分分析（PCA）。进行主成分 - 线性判别分析（PCA-LDA）时，先通过 t 检验筛选组间差异显著的主成分，仅将筛选后的有效参数纳入线性判别分析模型。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）最多纳入 10 个潜在变量，逐步增加变量数量，直至模型性能不再提升。采用留一法交叉验证评估模型分类效果，同步计算准确率、灵敏度、特异度及受试者工作特征曲线下面积（AUROC）。
三、结果与讨论
3.1. 肌肉疾病组与非肌肉疾病组对比
肌肉疾病组与非肌肉疾病组的肌肉样本拉曼光谱，均出现肌肉组织特征性吸收峰，包括酰胺 Ⅲ（1250–1305 cm∧（-1））、蛋白质 / 脂质的亚甲基弯曲振动峰（1446 cm∧（-1））以及酰胺 Ⅰ（1647 cm∧（-1））（图 1.）。各特征峰的初步归属参考现有研究文献。差分光谱结果显示，非肌肉疾病组样本在 930 cm∧（-1）（脯氨酸）、1080 cm∧（-1）（磷脂）、1123 cm∧（-1）（蛋白质 / 脂质）、1337 cm∧（-1）（核酸）、1451 cm∧（-1）（蛋白质 / 脂质）和 1655 cm∧（-1）（酰胺 Ⅰ）波段的信号相对保留完好。
图1. 拉曼光谱：确诊患有及未患有肌肉疾病患者的肌肉活检样本。无肌肉疾病病理特征患者的平均光谱±标准差（黑色，上方曲线），以及肌肉疾病患者的平均光谱（红色，下方曲线）。关键光谱区间以蓝色条形标注。
为进一步分析两组样本的差异，研究人员开展多元统计分析（PCA-LDA）（图 2.）。两组样本的线性判别函数得分存在显著统计学差异（图 2.（c））。平均光谱（每份样本对应一条光谱）与未平均原始光谱（每份样本多条光谱）的线性判别函数得分分布详见 ESI 图 3.。线性判别载荷图表明，935 cm∧（-1）（蛋白质 / 糖原）、1045 cm∧（-1）（脯氨酸）、1123 cm∧（-1）（蛋白质 / 脂质）、1340 cm∧（-1）（核酸）以及 1450–1460 cm∧（-1）（蛋白质 / 脂质）波段为正向贡献特征峰；1025 cm∧（-1）（碳水化合物）、1420 cm∧（-1）（脂质）等波段则呈现负向贡献。PCA-LDA 模型的总体分类准确率为 70.5%，PLS-DA 模型分类准确率可达 77.3%（表 2.）。
图2. 确诊肌肉疾病与非肌肉疾病患者肌肉活检样本的对比。（a）. 平均光谱差值（非肌肉疾病组减去肌肉疾病组），标注显著特征峰。（b）. PCA-LDA分析所得LDF评分。（c）. 线性判别结果，标注关键特征光谱区间。
表2. 光纤拉曼光谱鉴别肌肉疾病的分类性能
本研究所有光谱数据均在无任何样品前处理的条件下采集，且未针对性聚焦样本局部病变区域定点检测；而在多数拉曼光谱生物医学研究中，常采用定点靶向采集模式。即便采用这种非靶向广谱采集方式，差分光谱与多元分析结果均证实，病变肌肉组织的 α- 螺旋结构蛋白整体含量降低，对应特征峰包含 935 cm∧（-1）、1300 cm∧（-1）、1655 cm∧（-1）等波段。该变化规律已在肌病小鼠模型研究中得到验证，同时也在肌病果蝇模型相关报道中被证实，有望成为适用于跨物种研究的肌肉疾病转化型生物标志物。
3.2. 不同类型肌肉疾病：线粒体肌病与非线粒体肌病对比
线粒体肌病组与非线粒体肌病组的平均拉曼光谱如图 3. 所示。线粒体肌病患者与其他病因肌病（非线粒体肌病）患者的差分光谱结果表明：线粒体肌病样本在 1040 cm∧（-1）（脯氨酸）、1105 cm∧（-1）（碳水化合物）、1140 cm∧（-1）（胶原蛋白）及 1210 cm∧（-1）（蛋白质）处的特征峰信号更为显著（图 4.）。非线粒体肌病样本则在 1005 cm∧（-1）（苯丙氨酸）、1300 cm∧（-1）（酰胺 Ⅲ：α- 螺旋、脂质）、1451 cm∧（-1）（蛋白质 / 脂质）与 1655 cm∧（-1）（酰胺 Ⅰ、α- 螺旋）处呈现特征信号（图 4.）。上述结果提示，非线粒体肌病样本中的 α- 螺旋结构蛋白含量相对保留完整。线性判别函数图谱显示：1087 cm∧（-1）（脂质）、1300 cm∧（-1）（酰胺 Ⅲ、α- 螺旋）、1334 cm∧（-1）（色氨酸）、1451 cm∧（-1）（蛋白质 / 脂质）、1655 cm∧（-1）（酰胺 Ⅰ）为正向贡献波段；935 cm∧（-1）（蛋白质 / 糖原）、1140 cm∧（-1）（胶原蛋白）、1210 cm∧（-1）（蛋白质）为负向贡献波段。线性判别函数得分分布详见 ESI 图 4.。基于平均光谱的分类结果显示，PCA-LDA 模型分类准确率为 74.1%，PLS-DA 模型分类准确率可达 88.9%（表 3.）。
图3. 拉曼光谱：线粒体肌病组与非线粒体肌病组。线粒体疾病患者的平均光谱±标准差（蓝色，上方曲线），以及非线粒体肌病患者的平均光谱（红色，下方曲线）。
图4. 线粒体肌病组与非线粒体肌病组的对比。(a). 平均光谱差值（线粒体肌病组减去非线粒体肌病组），标注显著特征峰。(b). 主成分-线性判别分析（PCA-LDA）得到的线性判别函数评分。(c). 标注关键特征光谱区间的线性判别分析结果。
表3. 光纤拉曼光谱对线粒体肌病与非线粒体肌病的鉴别分类性能
本研究可获取的患者样本数量有限，会对本次分类结果的解读造成一定局限。罕见肌肉疾病的临床样本采集难度较大，在此背景下，仍有必要通过扩大样本量开展后续研究，验证本次试验结论，进一步挖掘拉曼光谱技术在肌肉疾病临床诊断中的应用价值。更大规模的研究还可引入更多复杂先进的机器学习算法，有望进一步提升整体诊断效能。扩大试验规模还可探究拉曼光谱能否实现更精细化的样本分型，例如区分线粒体肌病的不同基因亚型、无肌病表现的线粒体疾病，或是鉴别肌营养不良与炎症性肌病。若可实现上述精准区分，拉曼光谱检测将能够为免疫组化、基因检测等后续针对性检查提供指导依据。通过大范围样本光谱图谱绘制，还有助于明确各类特征性病理结构对应的专属光谱指纹，例如萎缩肌纤维、再生肌纤维、炎症细胞浸润及结缔组织病变等。目前，高分辨率显微测绘设备所采集的光谱数据，能否直接适配光纤检测系统，尚无明确结论，但不同设备间的数据互通与转化技术正在快速发展。
光纤拉曼光谱技术的突出优势之一，在于具备活体原位检测的应用潜力。研究人员利用同款设备，已在两种神经系统疾病小鼠模型中，完成活体肌肉组织的原位光谱采集，包括肌萎缩侧索硬化与杜氏肌营养不良。该检测方式未对活体肌肉组织产生明显损伤，这也为该技术应用于人体临床活体检测提供了理论依据。肌肉组织活体拉曼光谱检测的临床落地，需获得相关监管机构审批，例如英国药品与健康产品管理局（MHRA）。面向临床活体应用场景，现有设备还需进行适应性改良，例如在常规注射针头内配置无菌一次性光纤组件。缩短光纤长度也可有效降低杂散背景信号干扰。尽管仍存在诸多待解决的问题，但光纤拉曼光谱的人体活体检测研究已取得实质性进展。拉曼光谱技术的临床转化仍面临多重挑战，主要集中在复杂数据分析体系、数据共享机制与专用检测设备研发等方面。英国工程与物理科学研究委员会临床红外与拉曼光谱研究网络、欧盟 COST 行动 Raman4Clinics 等专项研究计划，正在推动统一标准操作流程的建立，持续提升振动光谱技术的临床应用认知度与推广价值。
四、结论
本研究探究了自发式光纤拉曼光谱在无样品前处理条件下短线股票配资，识别人体肌肉病变组织的应用潜力。试验数据证实，该技术不仅能够高效筛查肌肉疾病，还可准确区分两类不同亚型的肌肉疾病，整体分类准确率良好。由于光纤探头可集成于常规医用注射针头内部，该技术有望实现人体活体原位检测，作为现有诊断手段的有效补充，具备床旁实时快速诊断的应用前景。综上，本研究为拉曼光谱技术应用于肌肉疾病的机制研究与临床检测，奠定了重要的前期研究基础。
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